Nano Lett.:增强细胞内动作电位记录的可扩展空心纳米柱电极

2023-05-22 来源:超分子新物质创制创新工坊   访问次数:11

近日,胡宁课题组在细胞电生理学领域取得进展,成果发表在国际顶级期刊Nano Letters,标题为“Scalable and Robust Hollow Nanopillar Electrode for Enhanced Intracellular Action Potential Recording”该论文第一作者为博士研究生方佳如,胡宁研究员为通讯作者,刘川教授、杨涛博士、李颖副教授为共同通讯作者。

电生理学是电兴奋细胞的一种独特性标志,可以进行疾病调查或药物评估。开发潜在的记录新工具是在细胞水平上准确探测细胞内电活动,以了解心脏疾病的潜在机制和探索先进的治疗策略的关键。近十年来,垂直纳米电极阵列成功地在电兴奋细胞及其网络中实现了高质量的细胞内电生理研究。然而,使用低成本纳米结构进行高成功率和高质量、长期的细胞内记录仍然是一个相当大的挑战。因此,有必要开发一种新策略来提高电信号记录的质量。

在本工作中,我们设计了一种可扩展且稳定的空心纳米柱矩阵,以研究精确几何调节对细胞内记录的影。利用方便的模板合成和微加工技术,制备出高度可伸缩的垂直空心纳米柱电极。空心纳米结构可以诱导细胞膜既包裹在纳米结构的壁上,又突出在纳米结构的孔中,以增强细胞-电极耦合。此外,我们通过调节纳米柱的高度来改善细胞-电极纳米界面,以实现高质量和长时间的细胞内动作电位记录,展示了一种实现高质量细胞内电生理研究的策略。

图一. 本工作所设计的垂直空心纳米柱电极

我们通过模板合成和微加工工艺制备了可伸缩的空心纳米柱电极,如图二所示。首先通过原子层沉积在多孔聚对苯二甲酸乙二酯(PET)膜表面沉积的Al2O3层。然后用电感耦合等离子体反应离子刻蚀对Al2O3层进行各向异性刻蚀,然后用氧等离子体刻蚀形成中空纳米柱。随后,使用标准光刻、Ti/Au (10 nm/50 nm)沉积和提升步骤,将包括电极、导线和垫片在内的导电层进行图案化。为了减少引线的电容电流泄漏,5 μm厚的SU-8作为绝缘层,根据SU-8图案,直径为30 μm的导电纳米柱电极被定义为有效记录位点。随后对器件进行封装、焊接以匹配生物传感调节集成系统,该系统可以执行电生理信号记录和细胞电穿孔。

图二. (A)垂直空心纳米柱电极的制作工艺;(B) 空心纳米柱电极器件图;(C)生物传感调节集成系统。

我们应用空心纳米柱电极对原代大鼠心肌细胞进行细胞内记录。空心纳米柱具有可伸缩的纳米柱调节,制备高度精0.5 ~ 1.5 μm的空心纳米柱器件。为了确定纳米柱的调节性能,我们使用了平面器件和三种空心纳米柱高度的空心纳米柱器件来进行动作电位记录。各类型器件所记录的细胞内动作电位具有相似的细胞内谱,表现出明显的去极化、复极化和静息相。为了增强细胞内记录的促进作用,我们进行了细胞外和细胞内记录的统计比较。我们从振幅、信噪比和细胞内振幅分布方面评估了平面器件和三种空心纳米柱器件的电生理记录质量。这些器件的细胞外记录显示出低质量的电生理信号,平均最大振幅低于0.14 mV,而空心纳米柱器件略微改善了信号质。电穿孔后,空心纳米柱器件实现了高质量的细胞内记录,信噪比超过34 dB。平面器件和0.51.01.5 μm中空纳米柱器件记录的心肌细胞内最大平均振幅分别为0.14±0.110.38±0.320.43±0.281.07±1.01 mV,远高于细胞外记录。不同高度的空心纳米柱引起不同的细胞-电极耦合状态和电穿孔效应。从统计测量结果来看,与其他器件相比,1.5 μm中空纳米柱电穿孔装置实现了高质量的细胞内记录。上述数据表明,空心纳米柱器件可以提供高电阻的膜密封,以提高信号的质量,实现直接访问细胞内部,并产生可靠的细胞内电位记录。

图三. 平面器件与不同高度空心纳米柱器件的电信号记录对比。

电穿孔后,平面器件记录的细胞内动作电位迅速衰减,并在约100 s内呈现出细胞外信号,而空心纳米柱器件记录的信号在此期间保持了细胞内的轮廓。0.51.0 μm中空纳米柱装置记录到的细胞内动作电位也在约200 s内衰减到50 μV,而1.5 μm中空纳米柱装置记录到的动作电位在这段时间内仍然保持在1.5 mV。与平面器件(109 s)0.5 μm (220 s)1.0 μm中空纳米柱器件(279 s)的细胞内短通道相比,1.5 μm中空纳米柱器件具有超过1个数量级的细胞内长通道,甚至超过100分钟(~ 6000 s),动作电位振幅迅速达到最大值(1.51 mV)。随后,纳米孔逐渐重新封闭,信号衰减至最大振幅的90% (250 s)70% (1105 s)50% (2090 s)30% (3821 s)10% (6000 s),衰减速率相近。结果表明,1.5 μm中空纳米柱电极可以显著延长细胞内记录时间,提供比平面电极多10倍以上的细胞内访问。根据表征结果,选择1.5 μm中空纳米柱器件作为后续药物筛选的最佳装置。

图四. 通过中空纳米柱电极可延长细胞内记录时间。

此外,这种高通量、微创的空心纳米柱器件可以允许连续几天记录心肌细胞内情况,并实现离子通道阻断药物评价。如图五所示,培养的细胞在每次电穿孔前后连续3天的典型电生理记录。电穿孔后,记录动作电位的形状,振幅和发放频率在连续3天是相似的,这表明该电极电穿孔具有生物相容性。此外,我们在2小时内通过空心纳米柱器件进行连续3次电穿孔进行细胞内记录,细胞活力的电生理状态很少受到影响。这表明了基于空心纳米柱电极的电穿孔技术可以对心肌细胞进行多次、安全、高效的细胞内记录,有助于改善长期的慢性药物效应。空心纳米柱电极电穿孔后的高度详细记录也使我们能够评估离子通道药物对心肌细胞动作电位的影响。我们通过测试维拉帕米(一种缩短动作电位的Ca2+通道阻滞剂)来展示心肌细胞电生理模型作为潜在药物筛选应用的例子。在不使用药物和使用维拉帕米的情况下,心肌细胞被电穿孔以记录动作电位。通过与对照信号(黑色痕迹)相比,100200 nM维拉帕米处理的心肌细胞放电率降低,动作电位时程(APD)增加。对振幅、发放速率和APD50的影响随着浓度的增加而增强。基于对典型药物的准确筛选结果,我们的空心纳米柱器件和系统的细胞内记录被证明是一个有用的工具,可以评估药物对心肌细胞电生理的细微影响。

图五. 连续数日多个细胞同步多点胞内动作电位记录及离子通道阻断药物对心肌细胞的影响。

该研究工作获得国家自然科学基金(62171483, 82061148011)资助。

Jiaru Fang, Dongxin Xu, Hao Wang, Jin Wu, Ying Li*, Tao Yang*, Chuan Liu*, Ning Hu*, Scalable and Robust Hollow Nanopillar Electrode for Enhanced Intracellular Action Potential Recording, Nano Letters, 2023, 23, 1, 243–251.

论文链接:https://pubs.acs.org/10.1021/acs.nanolett.2c04222


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